Recuento de coliformes fecales en placa

Práctica 12 

Recuento de coliformes fecales en placa 

Objetivos 

El objetivo de esta práctica consiste en determinar el número de coliformes fecales que se encuentran en un cultivo microbiano. 

Fundamentos 

Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

Composición:

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Peptona	10.0	Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y distribuir agitando suavemente.
Lactosa	5.0
Sacarosa	5.0
Fosfato dipotásico	2.0
Agar	13.5
Eosina	0.4
Azul de metileno	0.065
pH final: 7.2 ± 0.2

Material y reactivos 

Materiales 

Medio EMB levine

Asa de siembra de Digralsky

Placas de petry

Alcohol

Mechero bunsen

Micropipeta de 1ml

Vasos de precipitado

Agua destilada

4 Tubos de ensayo

Mechero

Gradilla

Procedimientos 

Primero preparamos la mesa con todo material necesario siempre y cuando hagamos limpiado la misma con lejía y agua destilada para evitar contaminaciones innecesarias.

Preparamos 4 tubos con 9 ml de agua destilada e iremos echando 1 ml de agua de muestra al primer tubo con ayuda de una micropipeta y puntas estériles. Después del primer tubo cogemos 1 ml y lo pasamos al segundo tubo, y así con todos los tubos. Esto se conoce como una dilución seriada, siendo 1:10 el primer tubo, 1:100 el segundo....y así sucesivamente.

Después cogemos 1 ml de cada tubo y lo llevamos a una placa de petri con agar verde brillante, siempre y cuando haga sido rotulado antes. Para finalizar con ayuda del asa de Digralsky impregnamos bien la placa con las diluciones para que estas se unan al medio.

Cálculos

55 colonias tubo 1 --> E.coli (Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado)

3 colonia       tubo 1 --> E faecalis (Incloras, pequeñas y puntiformes)

UFC/ml = nº colonias x Din (x10)* / Din 1ml    --> *Cambia según el tubo del que se halla realizado(x10 tubo 1, x100 tubo 2, x1000 tubo 3, x10000 tubo 4)

Tubo 1 : UFC/ml= 55 x 10/1= 550 UFC/ml de E.coli

Tubo 2, 3 ,4 no se cuentan porque son menos de 30 (deben contarse cuando hay entre 30 y 300)

Resultados 

Microorganismos	Tipo de Colonia
Escherichia coli ATCC 25922	Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603	Mucosas, rosa púrpura, confluentes
Proteus mirabilis ATCC 43071	Incoloras
Enterococcus faecalis ATCC 29212	Incoloras, pequeñas, puntiformes
Shigella flexneri ATCC 12022	Incoloras
Salmonella typhimurium ATCC 14028	Incoloras