Preparación escala Mac Farland y recuento de microorganismos por turbidez
Objetivos
Establecer número de microorganismos en la muestra de agua peptonada mediante un método nefelométrico
Fundamentos
El espectrofotómetro es un aparato de uso habitual en cualquier laboratorio de tratamiento de aguas. Mide la densidad óptica, es decir, la absorbancia (luz transmitida a través de una suspensión). Se debe realizar una curva estándar para relacionar los valores de absorbancia con la masa bacteriana en una muestra problema.
La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta a longitudes de onda (λ) cortas.
Se mide el número de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) usando la siguiente tabla:
ESCALA MCFARLAND
|
||||||||
Nº
|
BaCl2 0,048M
|
H2SO4 0,36M
|
Vf
|
Nº Células
|
||||
ml
|
ml
|
ml
|
||||||
0,5
|
0,05
|
9,95
|
10
|
1,5 ·
108
|
||||
1
|
0,1
|
9,9
|
10
|
3 · 108
|
||||
2
|
0,2
|
9,8
|
10
|
6 · 108
|
||||
3
|
0,3
|
9,7
|
10
|
9 · 108
|
||||
4
|
0,4
|
9,6
|
10
|
12 · 108
|
||||
5
|
0,5
|
9,5
|
10
|
15 · 108
|
||||
6
|
0,6
|
9,4
|
10
|
18 · 108
|
||||
7
|
0,7
|
9,3
|
10
|
21 · 108
|
||||
8
|
0,8
|
9,2
|
10
|
24 · 108
|
||||
9
|
0,9
|
9,1
|
10
|
27 · 108
|
||||
10
|
1
|
9
|
10
|
30 · 108
|
||||
Se preparan los tubos
contemplados en dicha tabla, con esas cantidades de sulfúrico y de cloruro de
bario y se rotulan con los números de la izquierda. Se usa para ello pipetas
del volumen adecuado, pipeteador y tubos de ensayo.
Materiales y reactivos
Materiales
Tubos de ensayo y tapón
Pipetas con diferentes volúmenes
Espectrofotómetro
Cubetas
Reactivos
Cloruro de bario 0,36 M
Ácido sulfúrico 0,048 M
Agua destilada
Agua de muestra peptonada
Procedimiento
Lo primero es medir la
absorbancia de los diferentes tubos que hemos preparado de la escala McFarland
y presentarlos en una tabla:
Nº TUBO
|
UFC
|
ABSORBANCIA
|
||
0
|
0
|
0
|
||
0,5
|
1,5 · 108
|
0,074
|
||
3
|
9 · 108
|
0,846
|
||
5
|
15 · 108
|
1,040
|
||
6
|
18 · 108
|
1,272
|
||
Para el Tubo 0 cogemos sólo
agua estéril para hacer el blanco en el espectrofotómetro.
Hemos cogido sólo cuatro
tubos porque son suficientemente representativos de la escala y además nos da
de sobra para hacer nuestra recta de calibrado.
De esta tabla sacaremos la siguiente para
facilitar el procedimiento matemático:
Nº TUBO
|
X
|
Y
|
X2
|
Y2
|
X·Y
|
|||
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
|||
0,5
|
1,5
|
0,074
|
2,25
|
0,0055
|
0,111
|
|||
3
|
9
|
0,846
|
81
|
0,716
|
7,614
|
|||
5
|
15
|
1,040
|
225
|
1,082
|
15,06
|
|||
6
|
18
|
1,272
|
324
|
1,618
|
22,9
|
|||
SUMATORIO
|
43,5
|
3,232
|
632,25
|
3,42
|
45,685
|
En estos datos se ha obviado la potencia de diez en el número de UFC, por lo que el resultado final ha de ser multiplicado por 108.
El procedimiento matemático
que hay que llevar a cabo seguidamente lo adjuntamos en estas fotos:
La ecuación pues de nuestra recta es esta --> Y = 0,0461 + 0,069X
Una vez hecho esto, tenemos que medir la
absorbancia de nuestra muestra para trasladarla a la ecuación.
Para medir la
absorbancia tenemos primero que restarle la turbidez del medio de cultivo a
nuestra muestra. Para ello ponemos en una cubeta agua peptonada estéril y
hacemos el blanco. Seguidamente ya podemos medir la absorbancia de nuestra
muestra en agua peptonada.
La absorbancia de la muestra medida en el espectrofotómetro es: A =
0,400
Este dato se sustituye en la
ecuación de nuestra recta por la variable Y y despejando X obtenemos el número
de UFC/ml de nuestra muestra.
Resultados
Usando la recta anterior y
despejando X, obtenemos que nuestra muestra problema tiene unas 5,13 · 108 UFC/ml.
No hay comentarios:
Publicar un comentario