Recuento enterococos fecales por filtración

Práctica 13 

Recuento de enterococos fecales por filtración 

Objetivos 

Contar las UFC/ml de enterococos fecales en 100 ml, 50 ml de agua de muestra y 50 ml de agua destilada estéril (1:1), a través de filtración al vacío, en un medio Slanetz-Barnley.

Fundamentos 

Es el indicador bacteriológico más eficiente para evaluar la calidad de agua de mar para uso recreativo, debido a que es muy resistente a las condiciones salinas de este medio y además, está relacionado directamente con gastroenteritis, enfermedades respiratorias, conjuntivitis y dermatitis, entre otras. 

La presencia de Enterococcus faecalis y E. faecium es usada frecuentemente para indicar contaminación de origen fecal, E. faecalis es considerado como un indicador de contaminación fecal de fuentes humanas, mientras que E. faecium y otras especies indican contaminación de otras fuentes.

Composición:

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Triptona	20.0	Disolver 43.5 g de medio en 1 litro de agua bidestilada. Calentar, agitando, hasta ebullición para su total homogeneización. Evitar el excesivo calentamiento y enfriar rápidamente. No autoclavar. El color final del medio es incoloro-paja. El medio rojo indica que ha sufrido exceso de calor..
Extracto de levadura	5.0
Glucosa	2.0
Fosfato dipotásico	4.0
Azida sódica	0.40
Cloruro de tetrazolio	0.10
Agar	12.0
pH final: 7.2 ± 0.2

Materiales y reactivos 

Materiales

Mechero

Vasos de precipitado (agua destilada estéril, agua muestra, alcohol)

Embudo

Probeta 100 ml

Pipeta Pasteur

Matraz Kitasato

Alcohol

Agua Destilada Estéril

Placa Petri estéril

Pinzas

Mechero Bunsen

Filtro reticulado

Procedimientos 

Primero preparamos los materiales necesarios y limpiamos la mesa con lejía y abundante agua destilada.

A continuación montamos el kitasato, llenamos un vaso de precipitado con alcohol y preparamos el medio, los filtros y encendemos el mechero.

Después cogemos un filtro, abrimos su envoltorio poco a poco y lo cogemos con unas pinzas, siempre y cuando estén flameadas con alcohol, lo colocamos en una placa de petri donde habrá agua esterilizada previamente para que se despegue la cuadrícula de la otra parte, cuando esto ocurra, cogemos la cuadrícula y la ponemos en la parte de abajo del kitasato. Colocamos la parte de arriba del kitasato y echamos el agua de muestra con el agua estéril ya mezclada en una proporción 1:1 para facilitar la filtración. 

A continuación pulsamos el botón del aparato que hace vacío para que empiece a absorber el agua e impregnar la cuadrícula. Cuando la filtración haya terminado, con las pinzas flameadas, cogemos la cuadrícula impregnada en bacterias y la pasamos al medio correspondiente, en este caso Slanezt-Barnley, intentado que no queden burbujas. 

Por último lo llevamos a la estufa a 40º

Resultados

Microorganismos	Características de las colonias
Escherichia coli MKTA 25922	No crecen
Bacillus subtilis MKTA 6633	No crecen
Enterococcus durans MKTA 10541	Colonias rosas-granates, pequeñas
Enterococcus faecalis MKTA 29212	Colonias rosas-granates, pequeñas

Recuento de coliformes fecales en placa

Práctica 12 

Recuento de coliformes fecales en placa 

Objetivos 

El objetivo de esta práctica consiste en determinar el número de coliformes fecales que se encuentran en un cultivo microbiano. 

Fundamentos 

Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

Composición:

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Peptona	10.0	Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y distribuir agitando suavemente.
Lactosa	5.0
Sacarosa	5.0
Fosfato dipotásico	2.0
Agar	13.5
Eosina	0.4
Azul de metileno	0.065
pH final: 7.2 ± 0.2

Material y reactivos 

Materiales 

Medio EMB levine

Asa de siembra de Digralsky

Placas de petry

Alcohol

Mechero bunsen

Micropipeta de 1ml

Vasos de precipitado

Agua destilada

4 Tubos de ensayo

Mechero

Gradilla

Procedimientos 

Primero preparamos la mesa con todo material necesario siempre y cuando hagamos limpiado la misma con lejía y agua destilada para evitar contaminaciones innecesarias.

Preparamos 4 tubos con 9 ml de agua destilada e iremos echando 1 ml de agua de muestra al primer tubo con ayuda de una micropipeta y puntas estériles. Después del primer tubo cogemos 1 ml y lo pasamos al segundo tubo, y así con todos los tubos. Esto se conoce como una dilución seriada, siendo 1:10 el primer tubo, 1:100 el segundo....y así sucesivamente.

Después cogemos 1 ml de cada tubo y lo llevamos a una placa de petri con agar verde brillante, siempre y cuando haga sido rotulado antes. Para finalizar con ayuda del asa de Digralsky impregnamos bien la placa con las diluciones para que estas se unan al medio.

Cálculos

55 colonias tubo 1 --> E.coli (Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado)

3 colonia       tubo 1 --> E faecalis (Incloras, pequeñas y puntiformes)

UFC/ml = nº colonias x Din (x10)* / Din 1ml    --> *Cambia según el tubo del que se halla realizado(x10 tubo 1, x100 tubo 2, x1000 tubo 3, x10000 tubo 4)

Tubo 1 : UFC/ml= 55 x 10/1= 550 UFC/ml de E.coli

Tubo 2, 3 ,4 no se cuentan porque son menos de 30 (deben contarse cuando hay entre 30 y 300)

Resultados 

Microorganismos	Tipo de Colonia
Escherichia coli ATCC 25922	Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603	Mucosas, rosa púrpura, confluentes
Proteus mirabilis ATCC 43071	Incoloras
Enterococcus faecalis ATCC 29212	Incoloras, pequeñas, puntiformes
Shigella flexneri ATCC 12022	Incoloras
Salmonella typhimurium ATCC 14028	Incoloras

Recuento coliformes totales por filtración

Práctica 11 

Recuento de coliformes totales por filtración 

Objetivos 

Contar las UFC/ml de coliformes totales en 100 ml de muestra, a través de filtración al vacío, en un medio ENDO. Comprender y realizar adecuadamente la determinación de coliformes totales en un medio. Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables.

Fundamentos 

En el medio de cultivo, la pluripeptona junto con la peptona, la tripteína y el extracto de levadura, aportan los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable. El fosfato dipotásico y el fosfato monopotásico otorgan la capacidad buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
Es un medio selectivo debido al lauril sulfato de sodio y al desoxicolato de sodio que inhiben el desarrollo de la flora acompañante, y es diferencial debido a la fermentación de la lactosa. 
Las bacterias fermentadoras de lactosa producen durante la fermentación aldehídos, que en combinación con la fucsina y el sulfito presentes en el medio le confieren a la colonia un brillo metálico, mientras que las colonias de las no fermentadoras son rosadas.

Composición:

Fórmula (en gramos por litro)
Pluripeptona	10.0
Peptona	5.0
Tripteína	5.0
Extracto de levadura	1.5
Lactosa	12.5
Cloruro de sodio	5.0
Fosfato dipotásico	4.375
Fosfato monopotásico	1.375
Lauril sulfato de sodio	0.05
Desoxicolato de sodio	0.1
Sulfito de sodio	2.1
Fucsina básica	1.05
pH final: 7.2 ± 0.2

Materiales y reactivos 

Materiales 

Vaso de precipitado x2 (agua muestra, alcohol)

Embudo

Probeta 100 ml

Pipeta Pasteur

Matraz Kitasato

Alcohol

Placa Petri estéril

Pinzas

Mechero Bunsen

Mechero

Filtro reticulado

Procedimientos 

Primero preparamos los materiales necesarios y limpiamos la mesa con lejía y abundante agua destilada.

A continuación montamos el kitasato, llenamos un vaso de precipitado con alcohol y preparamos el medio, los filtros y encendemos el mechero.

Después cogemos un filtro, abrimos su envoltorio poco a poco y lo cogemos con unas pinzas, siempre y cuando estén flameadas con alcohol, lo colocamos en una placa de petri donde habrá agua esterilizada previamente para que se despegue la cuadrícula de la otra parte, cuando esto ocurra, cogemos la cuadrícula y la ponemos en la parte de abajo del kitasato. Colocamos la parte de arriba del kitasato y echamos el agua de muestra con el agua estéril ya mezclada en una proporción 1:1 para facilitar la filtración. 

A continuación pulsamos el botón del aparato que hace vacío para que empiece a absorber el agua e impregnar la cuadrícula. Cuando la filtración haya terminado, con las pinzas flameadas, cogemos la cuadrícula impregnada en bacterias y la pasamos al medio correspondiente, en este caso ENDO, intentado que no queden burbujas. 

Por último lo llevamos a la estufa a 37º

Resultados 

Microorganismos	Crecimiento	Características de las colonias
Escherichia coli ATCC 25922	Bueno	Brillo metálico
Proteus mirabilis ATCC 43071	Bueno	Incoloro
Staphylococcus aureus ATCC 25923	Inhibido	------

Recuento aerobios mesófilos por filtración

Práctica 10

Recuento aerobios mesófilos por filtración 

Objetivos

Recontar los aerobios mésofilos presentes en el cultivo PCA y hacer una siembre mediante filtración por kitasato 

Fundamentos 

La productividad de este medio, está basada en el alto contenido nutricional de sus componentes, que permite el desarrollo de las bacterias presentes en la muestra. Cuando se analiza leche y productos lácteos algunos autores recomiendan suplementarla con leche descremada estéril de uso bacteriológico en una proporción de 1 g por litro.

Composición:

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Extracto de levadura	2.5	Suspender 23,5 g en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición con agitación constante. Distribuir. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C.
Tripteína	5.0
Glucosa	1.0
Agar	15.0
pH final: 7.0 ± 0.2

Materiales y reactivos 

Materiales 

Mechero

Vasos de precipitado (agua destilada estéril, agua muestra, alcohol)

Embudo

Probeta 100 ml

Pipeta Pasteur

Matraz Kitasato

Alcohol

Agua Destilada Estéril

Placa Petri estéril

Pinzas

Mechero Bunsen

Filtro reticulado

Procedimientos 

Primero preparamos los materiales necesarios y limpiamos la mesa con lejía y abundante agua destilada.

A continuación montamos el kitasato, llenamos un vaso de precipitado con alcohol y preparamos el medio, los filtros y encendemos el mechero.

Después cogemos un filtro, abrimos su envoltorio poco a poco y lo cogemos con unas pinzas, siempre y cuando estén flameadas con alcohol, lo colocamos en una placa de petri donde habrá agua esterilizada previamente para que se despegue la cuadrícula de la otra parte, cuando esto ocurra, cogemos la cuadrícula y la ponemos en la parte de abajo del kitasato. Colocamos la parte de arriba del kitasato y echamos el agua de muestra con el agua estéril ya mezclada en una proporción 1:1 para facilitar la filtración. 

A continuación pulsamos el botón del aparato que hace vacío para que empiece a absorber el agua e impregnar la cuadrícula. Cuando la filtración haya terminado, con las pinzas flameadas, cogemos la cuadrícula impregnada en bacterias y la pasamos al medio correspondiente, en este caso PCA, intentado que no queden burbujas. 

Por último lo llevamos a la estufa a 37º

Resultados 

Microorganismos	Crecimiento
Staphylococcus aureus ATCC 25923	Bueno
Bacillus cereus ATCC 10876	Bueno
Escherichia coli ATCC 25922	Bueno
Lactobacillus fermentum ATCC 9338	Regular
Streptococcus agalactiae ATCC 13813	Bueno

Recuento salmonella en placa

Práctica 9

Recuento salmonella en placa 

Objetivos 

Cultivar salmonella en placa y hacer recuento de la misma.

Fundamentos 

El verde brillante: Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella spp., excepto S. typhi y S. paratyphi, a partir de muestras clínicas, alimentos, y otros materiales de importancia sanitaria. No se recomienda para el aislamiento de Shigella spp.

Es de un valor excepcional cuando se investiga un gran número de muestras de heces o alimentos, por su alta capacidad de diferenciación de las colonias sospechosas.

En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la fermentación de azúcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el verde brillante actúa como agente selectivo.

Composición: 

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Pluripeptona	10.0	Suspender 58 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 2 o 3 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos. Secar la superficie del medio por unos minutos en la estufa.
Extracto de levadura	3.0
Cloruro de sodio	5.0
Lactosa	10.0
Sacarosa	10.0
Rojo fenol	0.08
Verde brillante	0.0125
Agar	20.0
pH final: 6.9 ± 0.2

Materiales y métodos 

Materiales 

Medio Verde Brillante

Asa de siembra de Digralsky

Placas de petry

Alcohol

Mechero bunsen

Micropipeta de 1ml

Vasos de precipitado

Agua destilada

4 Tubos de ensayo

Mechero

Gradilla

Procedimientos

Primero preparamos la mesa con todo material necesario siempre y cuando hagamos limpiado la misma con lejía y agua destilada para evitar contaminaciones innecesarias.

Preparamos 4 tubos con 9 ml de agua destilada e iremos echando 1 ml de agua de muestra al primer tubo con ayuda de una micropipeta y puntas estériles. Después del primer tubo cogemos 1 ml y lo pasamos al segundo tubo, y así con todos los tubos. Esto se conoce como una dilución seriada, siendo 1:10 el primer tubo, 1:100 el segundo....y así sucesivamente.

Después cogemos 1 ml de cada tubo y lo llevamos a una placa de petri con agar verde brillante, siempre y cuando haga sido rotulado antes. Para finalizar con ayuda del asa de Digralsky impregnamos bien la placa con las diluciones para que estas se unan al medio.

Cálculos 

264 colonias tubo 1 --> salmonella (Blanquecinas y pequeñas)

1 colonia       tubo 1 --> E. Coli (Grandes, amarillentas)

UFC/ml = nº colonias x Din (x10)* / Din 1ml    --> *Cambia según el tubo del que se halla realizado(x10 tubo 1, x100 tubo 2, x1000 tubo 3, x10000 tubo 4)

Tubo 1 : UFC/ml= 264 x 10/1= 2640 UFC/ml de salmonella

Tubo 2, 3 ,4 no se cuentan porque son menos de 30 (deben contarse cuando hay entre 30 y 300)

Resultados 

Microorganismos	Características de las colonias
Escherichia coli	Amarillo-verdosas sobre fondo amarillento
Salmonella	Rosas, blancas o transparentes sobre fondo rojo
Shigella flexneri. ATCC 12022	No crecen
Staphylococcus aureus ATCC 25923	No crecen

Preparación escala Mac Farland y recuento de microorganismos por turbidez

Práctica 8 

Preparación escala Mac Farland y recuento de microorganismos por turbidez 

Objetivos

Establecer número de microorganismos en la muestra de agua peptonada mediante un método nefelométrico 

Fundamentos 

El espectrofotómetro es un aparato de uso habitual en cualquier laboratorio de tratamiento de aguas. Mide la densidad óptica, es decir, la absorbancia (luz transmitida a través de una suspensión). Se debe realizar una curva estándar para relacionar los valores de absorbancia con la masa bacteriana en una muestra problema. 

La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta a longitudes de onda (λ) cortas. 

Se mide el número de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) usando la siguiente tabla:

ESCALA MCFARLAND
Nº		BaCl2 0,048M		H2SO4 0,36M		Vf		Nº Células
		ml		ml		ml
0,5		0,05		9,95		10		1,5 · 108
1		0,1		9,9		10		3 · 108
2		0,2		9,8		10		6 · 108
3		0,3		9,7		10		9 · 108
4		0,4		9,6		10		12 · 108
5		0,5		9,5		10		15 · 108
6		0,6		9,4		10		18 · 108
7		0,7		9,3		10		21 · 108
8		0,8		9,2		10		24 · 108
9		0,9		9,1		10		27 · 108
10		1		9		10		30 · 108

Se preparan los tubos contemplados en dicha tabla, con esas cantidades de sulfúrico y de cloruro de bario y se rotulan con los números de la izquierda. Se usa para ello pipetas del volumen adecuado, pipeteador y tubos de ensayo.

  

Materiales y reactivos 

Materiales

Tubos de ensayo y tapón 

Pipetas con diferentes volúmenes 

Espectrofotómetro 

Cubetas 

Reactivos 

Cloruro de bario 0,36 M

Ácido sulfúrico 0,048 M

Agua destilada

Agua de muestra peptonada 

Procedimiento 

Lo primero es medir la absorbancia de los diferentes tubos que hemos preparado de la escala McFarland y presentarlos en una tabla:

Nº TUBO		UFC		ABSORBANCIA
0	0		0
0,5		1,5 · 108		0,074
3		9 · 108		0,846
5		15 · 108		1,040
6		18 · 108		1,272

Para el Tubo 0 cogemos sólo agua estéril para hacer el blanco en el espectrofotómetro.

Hemos cogido sólo cuatro tubos porque son suficientemente representativos de la escala y además nos da de sobra para hacer nuestra recta de calibrado.

De esta tabla sacaremos la siguiente para facilitar el procedimiento matemático:

Nº TUBO		X		Y	X2	Y2		X·Y
0		0		0	0	0		0
0,5		1,5		0,074	2,25	0,0055		0,111
3		9		0,846	81	0,716		7,614
5		15		1,040	225	1,082		15,06
6		18		1,272	324	1,618		22,9
SUMATORIO		43,5		3,232	632,25	3,42		45,685

En estos datos se ha obviado la potencia de diez en el número de UFC, por lo que el resultado final ha de ser multiplicado por 10⁸.

El procedimiento matemático que hay que llevar a cabo seguidamente lo adjuntamos en estas fotos: 

La ecuación pues de nuestra recta es esta -->  Y = 0,0461 + 0,069X

Una vez hecho esto, tenemos que medir la absorbancia de nuestra muestra para trasladarla a la ecuación.

Para medir la absorbancia tenemos primero que restarle la turbidez del medio de cultivo a nuestra muestra. Para ello ponemos en una cubeta agua peptonada estéril y hacemos el blanco. Seguidamente ya podemos medir la absorbancia de nuestra muestra en agua peptonada.

La absorbancia de la muestra medida en el espectrofotómetro es: A = 0,400

Este dato se sustituye en la ecuación de nuestra recta por la variable Y y despejando X obtenemos el número de UFC/ml de nuestra muestra.

Resultados 

Usando la recta anterior y despejando X, obtenemos que nuestra muestra problema tiene unas 5,13 · 10⁸ UFC/ml.