Tinción de Gram
Objetivos
Realizar la tinción de Gram de una muestra de agua concreta
Fundamentos
Diferenciar mediante la tinción
entre las paredes celulares de las bacterias Gram negativa y Gram negativa.
Mientras que la pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa
capa depeptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos, la capa de
peptidoglicano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una
segunda membrana plasmática exterior (descomposición distinta a la interna) por
medio de lipoproteínas. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen
diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave
es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared
celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción
que las Gram negativas.
Materiales y métodos
Materiales
Cubeta de
cristal
Puente de
tinción
Mechero bunsen
Vaso de
precipitado
Pipeta
Pasteur x3
Asa de
siembra
Portaobjetos
Agua
destilada
Papel
secante
Reactivos
Lugol
Alcohol - acetona 7:3
Safranina
Cristal violeta
Procedimientos
Para empezar ponemos un papel de filtro debajo de todos los reactivos para no manchar nada, ya que estos reactivos no saltan con facilidad. Después preparamos todos los materiales necesarios para hacer la práctica.
Cuando tenemos todo lo necesario listo cogemos un porta para poner la muestra, pueden ocurrir dos cosas en cuanto al estado de la muestra, es decir, que sea un medio líquido y que no haga falta echar solución salina, o que sea un medio sólido y necesitemos poner un poco de solución salina en el porta para diluir los microorganismos. En nuestro caso fue líquido con lo cual no hizo falta poner la solución.
Después de disgregar la colonia la dejamos secar al aire o bien poniéndola encima del mechero a una distancia considerable. Cuando esté totalmente seco procedemos a fijar las bacterias pasándolas por el mechero a una distancia muy pequeña y dejándolas unos segundos en la llama.
Con la primera parte del procedimiento acabada vamos a proceder a tintar la muestra:
Primero utilizamos el cristal violeta encima de la muestra cubriéndola por completo durante 1 min cronometrado, cuando se acabe el tiempo establecido limpiamos con agua del grifo, ya que tiene el pH correcto, hasta que no quede rastro de cristal violeta. Lo siguiente será fijar el color a las bacterias con el lugol durante 1 min también y cubriéndolas, y eliminar el sobrante con mucha agua.
Ahora utilizaremos alcohol-acetona 7:3 para eliminar el resto de tinte de las bacterias, el cual dejaremos 40 seg porque puede estropear la práctica si lo dejamos más tiempo. Al tiempo finalizado limpiamos con mucha agua.
Por último tintaremos las bacterias que nos quedan para hacer contraste con las Gram +, para ello utilizaremos la safranina durante 1 min cubriendo todas las bacterias y eliminando el sobrante con mucho agua cuando el min pase.
Con la segunda parte del procedimiento concluida procedemos a observar en el microscopio las bacterias que tenemos de nuestro tinte con el aumento 100x con su respectivo aceite
Cuando tenemos todo lo necesario listo cogemos un porta para poner la muestra, pueden ocurrir dos cosas en cuanto al estado de la muestra, es decir, que sea un medio líquido y que no haga falta echar solución salina, o que sea un medio sólido y necesitemos poner un poco de solución salina en el porta para diluir los microorganismos. En nuestro caso fue líquido con lo cual no hizo falta poner la solución.
Después de disgregar la colonia la dejamos secar al aire o bien poniéndola encima del mechero a una distancia considerable. Cuando esté totalmente seco procedemos a fijar las bacterias pasándolas por el mechero a una distancia muy pequeña y dejándolas unos segundos en la llama.
Con la primera parte del procedimiento acabada vamos a proceder a tintar la muestra:
Primero utilizamos el cristal violeta encima de la muestra cubriéndola por completo durante 1 min cronometrado, cuando se acabe el tiempo establecido limpiamos con agua del grifo, ya que tiene el pH correcto, hasta que no quede rastro de cristal violeta. Lo siguiente será fijar el color a las bacterias con el lugol durante 1 min también y cubriéndolas, y eliminar el sobrante con mucha agua.
Ahora utilizaremos alcohol-acetona 7:3 para eliminar el resto de tinte de las bacterias, el cual dejaremos 40 seg porque puede estropear la práctica si lo dejamos más tiempo. Al tiempo finalizado limpiamos con mucha agua.
Por último tintaremos las bacterias que nos quedan para hacer contraste con las Gram +, para ello utilizaremos la safranina durante 1 min cubriendo todas las bacterias y eliminando el sobrante con mucho agua cuando el min pase.
Con la segunda parte del procedimiento concluida procedemos a observar en el microscopio las bacterias que tenemos de nuestro tinte con el aumento 100x con su respectivo aceite
Resultados
Presencia de bacilococos en la muestra de color rojo claro
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