Recuento salmonella en placa

Práctica 9

Recuento salmonella en placa 

Objetivos 

Cultivar salmonella en placa y hacer recuento de la misma.

Fundamentos 

El verde brillante: Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella spp., excepto S. typhi y S. paratyphi, a partir de muestras clínicas, alimentos, y otros materiales de importancia sanitaria. No se recomienda para el aislamiento de Shigella spp.

Es de un valor excepcional cuando se investiga un gran número de muestras de heces o alimentos, por su alta capacidad de diferenciación de las colonias sospechosas.

En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la fermentación de azúcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el verde brillante actúa como agente selectivo.

Composición: 

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Pluripeptona	10.0	Suspender 58 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 2 o 3 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos. Secar la superficie del medio por unos minutos en la estufa.
Extracto de levadura	3.0
Cloruro de sodio	5.0
Lactosa	10.0
Sacarosa	10.0
Rojo fenol	0.08
Verde brillante	0.0125
Agar	20.0
pH final: 6.9 ± 0.2

Materiales y métodos 

Materiales 

Medio Verde Brillante

Asa de siembra de Digralsky

Placas de petry

Alcohol

Mechero bunsen

Micropipeta de 1ml

Vasos de precipitado

Agua destilada

4 Tubos de ensayo

Mechero

Gradilla

Procedimientos

Primero preparamos la mesa con todo material necesario siempre y cuando hagamos limpiado la misma con lejía y agua destilada para evitar contaminaciones innecesarias.

Preparamos 4 tubos con 9 ml de agua destilada e iremos echando 1 ml de agua de muestra al primer tubo con ayuda de una micropipeta y puntas estériles. Después del primer tubo cogemos 1 ml y lo pasamos al segundo tubo, y así con todos los tubos. Esto se conoce como una dilución seriada, siendo 1:10 el primer tubo, 1:100 el segundo....y así sucesivamente.

Después cogemos 1 ml de cada tubo y lo llevamos a una placa de petri con agar verde brillante, siempre y cuando haga sido rotulado antes. Para finalizar con ayuda del asa de Digralsky impregnamos bien la placa con las diluciones para que estas se unan al medio.

Cálculos 

264 colonias tubo 1 --> salmonella (Blanquecinas y pequeñas)

1 colonia       tubo 1 --> E. Coli (Grandes, amarillentas)

UFC/ml = nº colonias x Din (x10)* / Din 1ml    --> *Cambia según el tubo del que se halla realizado(x10 tubo 1, x100 tubo 2, x1000 tubo 3, x10000 tubo 4)

Tubo 1 : UFC/ml= 264 x 10/1= 2640 UFC/ml de salmonella

Tubo 2, 3 ,4 no se cuentan porque son menos de 30 (deben contarse cuando hay entre 30 y 300)

Resultados 

Microorganismos	Características de las colonias
Escherichia coli	Amarillo-verdosas sobre fondo amarillento
Salmonella	Rosas, blancas o transparentes sobre fondo rojo
Shigella flexneri. ATCC 12022	No crecen
Staphylococcus aureus ATCC 25923	No crecen